Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity v Brně

Brno 3. února 1999

Po záštitou děkana Přírodovědecké fakulty MU Prof. RNDr. Rostislava Brzobohatého,CSc. a děkana lékařské fakulty MU Prof.MUDr. Jiřího Vorlíčka,DrSc.

 Fotografie

 

Sborník abstraktů

Dne 3. února na brněnské přírodovědecké fakultě MU pod záštitou děkanů PřF a LF proběhlo třetí pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů. Zúčastnilo se ho přes 70 vědeckých pracovníků z vysokých škol, výzkumných ústavů a nemocnic z  celé České republiky. Po celý den probíhal zajímavý odborný program ve formě přednášek (25) a plakátových sdělení (20). Jednání se neslo v duchu zavádění nových technologií a postupů v biochemii a molekulární biologii, které jsou směrovány k miniaturizaci a automatizaci.

První část přednášek byla věnována molekulární diagnostice patogenních bakterií a metabolismu prokaryotických buněk. Další přednášky se zabývaly diagnostikou závažných metabolických chorob a diagnostikou krevních malignit. Zajímavé výsledky přinesly referáty věnované proteinu p53, cytochromu P450, peptidové nukleové kyselině, alkalické fosfataze a retinoidům. Samostatný blok přednášek byl věnován výzkumu rostlinné fyziologie pomocí klasických a molekulárně biologických metod. V přednášce o biočipech byl zdůrazněn trend miniaturizace a promyšleného využívání osvědčených principů (např. hybridizace).

Institut chemické technologie VŠCHT, Praha

Modifikace syntetických polymerů iontovou implantací zlepšuje adhezi a růst buněk v kulturách. V dřívějších pracech jsme ukázali, že cévní hladké svalové buňky adherují větší plochou a ve vyšším počtu k polystyrenové růstové podložce ozářené 5x10¹² a 5x10¹⁴ iontů fluoru/cm² (1,2,3). Zlepšení adheze bylo důsledkem zvýšené hydrofilie a karbonizace polymeru. V tomto sdělení popisujeme změny ve velikosti a proliferaci buněk, jakož i expresi několika cytoskeletálních a povrchově lokalizovaných molekul v cévních hladkých svalových a bovinních endotheliálních buňkách pěstovaných na polystyrenových podložkách ozářených 5x10¹² a 5x10¹⁴ iontů fluoru/cm^2. Zjistili jsme, že oba typy buněk adherovaly k takto modifikovanému polystyrenu větší plochou a buňky byly rezistentnějsí k uvolnění od růstové podložky proteolytickými enzymy. V těchto kulturách bylo rovněž pozorováno nižší spontánní uvolňování buněk od podložky ve stadiu konfluentního nárůstu populace. Tyto buňky byly rovněž větší a obsahovaly více bílkovin. Jak bylo prokázáno mikroskopickou imunocytochemií a metodou ELISA, hladké svalové buňky obsahovaly ve vyšší koncentraci vimentin, alfa-aktin, jakož i dvě adhezní molekuly imunoglobulinové nadrodiny (ICAM-1, VCAM-1). Četnost buněk v S-fázi, stanovená průtokovou cytofluorimetrií, byla v kulturách s modifikovaným polystyrenem nezměna nebo jen mírně zvýšena. V populaci endotheliálních buněk bylo zjištěno pouze zvýšení vimentinu, talinu a ICAM-1, nikoliv však VCAM-1. a ELAM-1. Pokud jde o obsah vinkulinu, talinu a alfa-v integrinu v hladkých svalových buňkách rostoucích na polystyrenu ozářeným nižší dávkou, bylo toto zvýšení proprocinální k změnám celkového obsahu bílkovin. V buňkách pěstovaných na polystyrenu ozářeným vyšší dávkou se tyto molekuly objevily rovněž ve vyšší koncentraci. Naše výsledky ukazují, že implantace polystyrenu ionty fluoru zvyšuje expresi několika molekulových species, které se účastní na adhesi a chemodiferenciaci buněk. Lepší adheze a diferenciace není provázena nadměrnou proliferací a expresí molekul atrahující buňky imunitního systému, což představuje příznivou okolnost pro případné použití takto modifikovaných polymerů pro konstrukci cévních bioprotéz.

(1) Bačáková et al. Biomaterials 17: 1121, 1996

Bartáková Iva¹, Mandl Martin², Zeman Jan¹

Důlní odpad uskladněný na haldě v lokalitě Zlaté Hory obsahuje až 70 % pyritu, který je v přírodních podmíkách oxidován chemicky kyslíkem a železitými ionty. Biochemická oxidace pomocí bakterie Thiobacillus ferrooxidans probíhá dle sumární rovnice:

Studovaný odpad byl totálně oxidován bakteriemi na výše uvedené produkty bez významné akumulace sirných meziproduktů.

Spontánní okyselování zlatohorské haldy doprovázené migrací těžkých kovů má negativní vliv na životní prostředí. Jednorázová alkalizace nevedla k účinné inhibici těchto procesů. Několikaměsíční alkalizace potlačila bakteriální činnost, po jejím skončení však následovala pouze lag fáze a došlo k znovuobnovení bakteriální aktivity.

Biooxidace odpadu byla vedle třepačkových experimentů sledována v kolonách, lépe simulujících přírodní podmínky odpadní haldy. Procento bakterií adsorbovaných na povrch minerálu bylo u kolonového uspořádání podstatně vyšší. V počáteční fázi se 84 % buněk zachytilo na koloně, zřejmě vrstva materiálu funguje jako biofiltr. V třepané suspenzi byl podíl adsorbovaných buněk menší než 20 %. Význam adsorpce v biodegradačním procesu není zcela vyjasněn.

Nízké koncentrace Fe²⁺, vyšší koncentrace Fe³⁺ a vyšší redoxní potenciál v koloně s bakteriemi v porovnání s kontrolou svědčí o aktivitě bakteriální kultury, která v prostředí haldy urychluje zvětrávání materiálu produkcí oxidantu Fe³⁺. Zastavení produkce Fe³⁺ po určité době je pouze zdánlivé vzhledem k postupnému srážení jeho nadbytku ve formě železitých minerálů.

Beránek Martin¹, Bureš J.², Palička Vladimír¹, Nejedlá Eliška³, Klánová Jana³

Incidence kolorektálního karcinomu v České republice má rostoucí tendenci. Nejasné etiologické pozadí znemožňuje nejen časnou laboratorní diagnostiku, ale i rozvoj účinné farmakologické léčby tohoto onemocnění. Cílem sdělení je prokázat možnost molekulárně biologického vyšetření přítomnosti bodových mutací v 12. kodónu K-ras genu v biopticky odebraných vzorcích kolorektálního karcinomu.

K-ras gen je lokalizován na 12p chromozómu. Obsahuje 4 kódující a 2 nekódující exony, a jeho expresí vzniká p21 protein s vnitřní GTPázovou aktivitou. Jeho fyziologickou funkcí, jako důležité součásti signálních buněčných kaskád, je zprostředkovat přenos podnětů z aktivovaných receptorů do buněčného jádra a stimulovat tak buněčnou proliferaci a diferenciaci. Bodové mutace (substituce) v K-ras genu (především v kodónech 12,13 a 61) mohou být jedním z faktorů, které inhibicí GTPázové aktivity proteinu p21 přispívají k nekontrolované proliferaci a maligní transformaci buněk tlustého střeva.

Soubor tvořilo 20 osob (14 mužů a 6 žen, věkový průměr souboru 65 ± 10 let) koloskopicky vyšetřených v KCVL FN HK. Pro amplifikaci ?xonu I byla užita enriched PCR/RFLP (MvaI) metoda. Detekce probíhala na 3,5% MetaPhor agarózovém gelu (FMC, Rockland, ME, USA). Konfirmace výsledků byla provedena automatickým analyzátorem ABI PRISM 310 (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA).

Přítomnost mutace v kodónu 12 byla prokázána v 11 z 20 (55%) vzorků. Výskyt mutací pokrýval všechny úseky tlustého střeva a rekta. Karcinomy klasifikované dle Dukese jako B obsahovaly mutace ve 4 z 9 (44%), C ve 3 z 4 (75%) a D v 1 ze 3 (33%) případů. Při hodnocení souboru dle věku v momentě stanovení diagnózy nebyly shledány statistické rozdíly (P > 0,05) mezi skupinou osob s a bez mutace (66,0 ± 9,5 vs. 66,1 ± 10,7). Přítomnost mutace tak neovlivňuje nástup klinických příznaků karcinomu. Substituce GGT® GTT a GGT ® GAT jsou dvě nejčastější mutace v kodónu 12 K-ras genu a v naší studii byly prokázány ve všech stupních rozvoje karcinomu. Bioptický materiál se jeví jako vhodný materiál pro hledání genetického pozadí kolorektálního karcinomu.

Sekvenování bylo zčásti podpořeno grantem č. VS 96096 MŠMT ČR.

Biodegradace sulfidů působením bakterie Thiobacillus ferrooxidans vede k okyselování životního prostředí kyselinou sírovou a k uvolnění těžkých kovů. Studium těchto procesů má rovněž význam v souvislosti s využitím této bakterie v biohydrometalurgii.

Enzym rhodanasa (thiosíran:kyanid sulfurtransferasa, EC 2.8.1.1.) je zřejmě součástí těchto procesů. Je odpovědný za přenos atomu síry z thiosíranu na kyanid

Pro stanovení enzymové aktivity rhodanasy byla vyvinuta nová citlivá metoda za použití kapilární zónové elektroforézy. Reakce byla prováděna přímo v mikrozkumavkách. Reakční směs o objemu 450 m l obsahovala 50 mM pufr HEPES (pH 8,5), 2,5 mM Na₂S₂O₃ a buněčný extrakt. Směs byla inkubována 3 min při reakční teplotě 25 ° C. Reakce byla zahájena přídavkem 50 m l 0,25 M KCN. Po požadované době byla buď zastavena přídavkem 10 m l 38% formaldehydu, nebo bylo stanoveno množství produktu pomocí CZE bez zastavení reakce (pak bylo možné sledovat tvorbu produktu v závislosti na čase pomocí sekvenčních běhů). Stanovení množství produktu reakce SCN^- pomocí CZE se provádělo v křemenné kapiláře o vnitřním průměru 75 m m, celkové délce 64,5 cm a efektivní délce 8,0 cm za použití základního elektrolytu 100 mM b -alanin/HCl (pH 3,5), separačního napětí 18 kV (negativní polarita), teploty kapiláry 25 ° C, detekce při 200 nm a tlakového dávkování 50 mbar/4 s přes krátký konec kapiláry (tzv. short-end injection).

Metoda byla využita ke stanovení těchto parametrů enzymu: pH optima (8,6), teplotního optima (25 ° C) a k orientačnímu stanovení Michaelisových konstant. Vzhledem ke své citlivosti (limit detekce 2,5 m M SCN^-) může nalézt uplatnění při simultánním stanovení intermediátů metabolismu bakterie Thiobacillus ferrooxidans a při stanovení thiokyanatanu v mnoha dalších aplikacích, a to i bez vazby na enzymové procesy.

Brauner Petr¹, Flachs Petr¹, Pavelka Stanislav^1,2, Kopecký Jaroslav¹

Využití protonového gradientu na vnitřní mitochondriální membráně nejrůznějších typů buněk může být pod kontrolou nejméně tří tzv. ”uncoupling proteinů” (UCP), které na základě strukturní homologie řadíme do rodiny mitochondriálních iontových přenašečů. Jejich úlohou je modulace úrovně spřažení mitochondriální syntézy ATP s transportem elektronů respiračním řetězcem. Uncoupling proteiny rozhodují, zda se protony vrátí do matrix prostřednictvím ATP-syntázy (za současné tvorby ATP) nebo mimo ni. V takovém případě se energie spojená s průchodem protonů přes membránu uvolňuje ve formě tepla.

První uncoupling protein (později označený jako UCP1) byl objeven již v roce 1976. Nachází se výhradně v hnědé tukové tkáni [1]. Hnědá tuková tkáň je díky přítomnosti UCP1 jediným specializovaným savčím orgánem, jehož primární fyziologickou funkcí je regulovaná tvorba tepla. Nenahraditelnou roli má nejen u novorozenců, ale i např. u hibernantů, jimž umožňuje zahřátí a probuzení ze zimního spánku. Do popředí zájmu obezitologů se UCP1 dostal poté, co byla prokázána stimulace jeho syntézy nadměrným příjmem potravy, tzv. dietou indukovaná termogeneze. Roku 1979 byla poprvé vyslovena myšlenka, že UCP1 může být regulátorem tělesné hmotnosti.

V polovině 90. let byly provedeny pokusy na transgenních myších, kterým byla navozena rezistence vůči obezitě díky ektopické expresi UCP1 v bílé tukové tkáni [2]. Teprve v poslední době bylo v naší laboratoři potvrzeno, že takto získaná rezistence vůči obezitě je důsledkem rozpřažení mitochondrií bílého tuku [3].

V bílé tukové tkáni myší byla prokázána pozitivní korelace mezi rezistencí k obezitě a expresí UCP2 a rovněž přímá indukce UCP2 vysokotukou dietou. Předpokládá se, že podobné závislosti existují i u člověka. U krys byla nalezena výrazná stimulace exprese UCP2 leptinem. UCP2 je tedy velice slibným mediátorem udržení hmotnostní homeostázy.

Přepokládá se, že UCP2 ovlivňuje jednak vývoj, jednak funkci buněk imunitního systému. Vysoké hladiny UCP2 byly nalezeny nejen v tkáňových makrofázích sleziny a brzlíku, ale např. i v játrech. Nedávno provedenými experimenty na myších játrech jsme prokázali, že za fyziologických podmínek je UCP2 exprimován pouze v jaterních makrofázích, nikoli v hepatocytech. Za zmínku stojí rovněž zjištění, že exprese UCP2 ve fetálních játrech je mnohem výraznější než u dospělých jedinců [4]. V rozmezí řádově několika hodin až dnů po porodu obsah UCP2 v játrech prudce klesá. Dále existují i údaje naznačující, že UCP2 může hrát důležitou roli v diferenciaci buněk hematopoetického systému.

Závěrem lze říci, že ačkoli uncoupling proteiny, jmenovitě UCP2, zásadním způsobem ovlivňují lidský, potažmo savčí energetický metabolismus, jejich regulace a jejich funkce zatím zůstávají neobjasněny a k jejich pochopení bude zapotřebí ještě řady dalších cílených experimentů.

Literatura

Brázdová Marie, Brázda Václav, Černocká Hana, Vojtěšek Bořivoj a Paleček Emil

V současnosti jsme ukázali, že protein p53 se váže preferenčně na superhelikální DNA in vitro v přítomnosti i bez přítomnosti p53CON sekvence . Produktem této vazby na agarózovém gelu je "žebřík" retardovaných proužků. Po imunoblotingu s protilátkou DO-1 dostaneme na membráně proužky p53 odpovídající DNA proužkům v gelu po obarvení ethidium bromidem, což ukazuje, že každý proužek žebříku obsahuje komplex DNA a p53. Intenzita a počet těchto proužků klesá při fyziologických koncentracích iontů zinku. Při vyšších koncentracích zinku je vazba proteinu p53 k DNA zcela inhibována. V rozporu s dříve publikovanými daty naznačujícími, že 100 mM zinek nemá vliv na vazbu p53 na p53CON v oligonukleotidu DNA, ukazujeme, že 5 - 20 mM zinek efektivně inhibuje vazbu p53 na p53CON ve fragmentech DNA. Také ukazujeme, že relativně nízké koncentrace dithiothreitolu (ale ne 2-merkaptoetanolu) snižují koncentraci volných zinečnatých iontů, a tímto zabraňují v inhibičním efektu zinku na vazbu p53 na DNA. Nikl a kobalt inhibují vazbu proteinu p53 na scDNA a na konsensus sekvenci v lineárních fragmentech méně než zinek. Ionty kobaltu jsou nejméně efektivní, pro úplnou inhibici vazby p53 je potřeba koncentrace větší než 100 mM Co²⁺. Modulace vazby proteinu p53 na DNA fyziologickými koncentracemi zinku může představovat nový způsob regulace aktivity p53 in vivo.

Bakteriální oxidace síry byla dosud studována zejména u bakterie Thiobacilus thiooxidans. Pro význam bakterie T. ferrooxidans v  biohydrometalurgii a biogeochemických procesech v sulfidových odpadech jsme studovali oxidaci síry touto bakterií. Síra je potenciálním meziproduktem (bio)oxidace sulfidových minerálů a její oxidace na kyselinu sírovou vede k okyselování prostředí.

Síra je ve vodě v podstatě nerozpustná a inertní molekula tvořící s největší četností osmiatomové cykly. Předmětem úvah zůstává význam a mechanismus adsorpce bakteriií na sirný povrch a její vztah k mechanismu sirné oxidace. Z našich výsledků lze dokumentovat korelaci mezi dobou lag fáze bakteriální oxidace a dobou ustanovení adsorpční rovnováhy. Zásadní vliv na sorpci buněk by mohla mít látka izolovaná z kultury po extrakci hydrofobními organickými rozpouštědly. Tato látka je vázaná na povrch bakterie, po její extrakci je už nadále ve vodném prostředí nerozpustná. Podle předběžných výsledků z rentgenové strukturní spektrometrie a NMR se jedná o polymerní látku s pyrenovým motivem. Aromatický systém by tedy mohl zajišťovat poměrně silnou hydrofobní interakci mezi povrchem síry a bakterií.

Proces oxidace síry na enzymové úrovni je lokalizován v buněčném cytosolu, vstup pevné síry do metabolismu bakterie je jedna z nezodpovězených otázek. Při studiu oxidace síry bakteriemi jsme potvrdili nezbytnou přítomnost redukovaného glutathionu, jehož předpokládané zapojení do oxidačního mechanismu v souladu s literárními poznatky je následucící:

S₈ X-GS₈-SH X-GS₈-SO₂H X-GS₇-SH + H₂SO₃    

X........ membrána nebo enzym

Polysulfid glutathionu vznikající chemicky je oxygenasou a hydrolasou převeden na siřičitanový iont, který je v respiračním řetězci za tvorby ATP oxidován na síranový iont.

Pozorovali jsme lineární průběh růstu bakterií a oxidace síry. Tvorba kyseliny sírové vede k téměř nulovým hodnotám pH. Výtěžek biomasy na substrát zůstává konstantní (v rámci chyb meření) v celém růstovém cyklu a rozsahu pH (4 - 0). Jelikož nedocházelo k limitaci kyslíkem nebo oxidem uhličitým (zdroj uhlíku), lineární kinetika by mohla svědčit pro limitaci metabolismu sirným substrátem, jehož solubilizace (adsorbovanými bakteriemi?) na využitelnou hydrofilnější síru může být úzkým místem a dle Monodovy kinetiky vést k lineárnímu růstu i lineární oxidaci síry. Je-li oxidace síry realizovaná pouze adsorbovanými bakteriemi, lze demonstrovat kinetický model, který v případě limitace sirného povrchu vede k lineární oxidaci síry. V počáteční fázi oxidace, kdy ještě nejsou obsazena všechna sorpční místa bakteriemi, je dle modelu možná exponenciální kinetika oxidace. Tento fakt jsme zatím nemohli z rozptylu našich dat potvrdit. Jednotlivé kroky limitace bakteriální oxidace síry budou předmětem dalšího studia.

Dadák Vladimír¹, Vrána Oldřich ² a Antalík Marián ³

Hydrolýza fosforečných monoesterů katalyzovaná fosfatázami je dlouho známou a velmi rozšířenou reakcí. V metabolických drahách může probíhat několika rozdílnými mechanismy. U alkalické fosfatázy (AP) vzniká v průběhu reakce fosfoserinový, v alkalickém prostředí nestálý intermediát, pro reakci je nezbytná přítomnost Zn²⁺ a Mg²⁺ iontů. Přirozený substrát AP zatím neznáme. Zájem o enzym byl zprvu dán možností diagnózy patologických stavů organismu a její výraznou orgánovou specifitou. Ta má svůj původ v rozdílné lokalizaci a expresi AP genů. Isoenzymy se výrazně odlišují citlivostí k inhibitorům a termostabilitou. U člověka je AP membránově vázaným glykoproteinem, bakteriální AP je rozpustná. Topografie aktivního místa bakteriálních i savčích AP je podobná. Vazba na membránu se uskutečňuje přes glykosylfosfatidylinositolovou (GPI) kotvu, jejíž mikroheterogenita u jednoho typu enzymu znásobuje variabilnost AP. Je překvapivé, že tuto kotvu nacházíme i u části enzymu vylučovaného do tělních tekutin.

Při studiu relaxace excitovaných tryptofanů zanořených v intestinálním proteinu jsme objevili schopnost AP modifikovat stukturu několika hemoproteinů, myoglobinu, cytochromu c aj. a to i bez předchozí fotoexcitace. Cyt c jsme pro jeho stálost a přitom vysokou konformační flexibilitu dále použili pro sledování změn vyvolaných přítomností AP (Biochim. Biophys. Acta 1297, 69-76 (1996). V nynější práci byla ve spolupráci tří pracovišť zkoumán mechanismus inteakce obou proteinů absorbční a fluorescenční spektroskopií, cirkulárním dichroismem, diferenciální mikrokalorimetrií a chromatografickými a elektromigračními technikami. Optické metody prokázaly změny v konformaci hemové štěrbiny cyt c a v expozici aromatických aminokyselin. Vznikající konformační intermediát(y) přechází v závislosti na pH prostředí ve stabilní cyt c(FeII). Chromatografická a spektrální analýza směsi prokázala tvorbu variabilních komplexů mezi oběma proteiny. Jejich vazebná geometrie se liší již v závislosti na poměru koncentrací jak ukázaly rozdíly v teplotách jejich denaturačního přechodu. Za fyziologických podmínek probíhá tvorba a přechod komplexů v několika časový odlišných fázích. Při použití přípravků intestinální AP lišících se podílem GPI jsme prokázali, že enzym s nejvyšším obsahem GPI reaguje s hemoproteinem nejrychleji a to i při vysoké iontové síle. U typu s menším obsahem GPI převažuje pomalá fáze (interval několika hodin) a její průběh závisí na iontové síle prostředí. V pomalé fázi interakce je cyt c vázán převážně na nativní AP dimer. Z výsledků lze uzavřít, že kromě dlouho studované nespecifické fosfomonoesterázové aktivity mají isoenzymy AP další bohaté možnosti působení na proteiny. Vysoká variabilnost interakce a extrémní citlivost k vnějším podmínkám svědčí pro její biologickou významnost.

Fojta Miroslav¹, Kubičárová Tatiana¹, Vojtěšek Bořivoj² a Paleček Emil¹

Bílkovina p53 je nádoroý˘ supresor, jehoI hlavním úkolem je zabránit akumulaci mutací v genomu buněk v důsledku replikace poškozené DNA. Tuto funkci plní prostřednictvím kontroly buněčného cyklu ve fázi G-1. Pokud je DNA v buňce poškozena, protein p53 prostřednictvím dalších regulačních proteinů zastaví buněčný cyklus a spustí reparační procesy; teprve potom následuje replikace DNA. Pokud je poškození DNA rozsáhlé, aktivuje p53 programovanou buněčnou smrt - apoptózu. Inaktivací proteinu p53 (mutace příslušného genu) je buňka vystavena zvýšenému riziku maligní transformace.

Protein p53 se skládá z několika funkčních domén. N-koncová doména bílkoviny nese funkci transkripčního aktivátoru a interaguje s dalšími transkripčními faktory. Centrální doména je zodpovídná za sekvenční specifickou vazbu na DNA. Tato část molekuly p53 obsahuje atom zinku koordinovaný třemi zbytky cysteinu jedním zbytkem histidinu; oxidací cysteinových zbytků se vazba p53 na cílovou sekvenci DNA inaktivuje. C-koncová část proteinu obsahuje oligomerizační doménu, dále oblast, která působí jako negativní regulátor specifické vazby p53 na DNA, a oblast zodpovědnou za sekvenční nespecifickou interakci p53 s poškozenou či jednořetězcovou DNA.

V naší laboratoři bylo v minulých letech zjištěno, že lidský protein p53 ”divokého typu” se váže s vysokou afinitou na negativní nadšroubovicovou (sc) DNA, a to bez ohledu na přítomnost cílové sekvence pro p53. V další práci jsme zjistili, že vazba p53 na scDNA je pouze částečně oslaben oxidací proteinu diamidem (bis[dimethylamid] kyseliny azodikarboxylové - toto činidlo selektivně oxiduje thiolové skupiny na disulfidové vazby); naproti tomu vazba p53 na její cílovou sekvenci v lineární DNA byla dle očekávání oxidací inaktivována zcela. Protein p53 vázaný v komplexu s scDNA byl výrazně chráněn proti oxidaci diamidem. Vazba jak redukované, tak oxidované p53 na scDNA byla inhibována v přítomnosti denaturované (ss) DNA.Tyto výsledky naznačují, že redukovaná p53 interaguje s scDNA jak svou centrální, tak C-koncovou doménou.

Oxidace p53 ”divokého typu” diamidem je za obvyklých podmínek prakticky ireverzibilní proces (tj. sekvenční specifickou interakci, ani interakci s scDNA odpovídající redukované p53 nelze reaktivovat přidáním nadbytku redukčního činidla dithiothreitolu). Naproti tomu bylo možno vazebnou aktivitu p53 obnovit, pokud byla bílkovina oxidována diamidem v přítomnosti 0,1 mM zinečnatých iontů. Pravděpodobným vysvětlením tohoto jevu je uvolnění atomu zinku z p53 v důsledku oxidace cysteinových zbytků. Pokud jsou zinečnaté ionty při zpětné redukci k dispozici v nadbytku, může dojít k rekonstituci aktivní konformace p53. Pokud však byly cysteinové zbytky p53 oxidovány do vyššího stupně než na disulfidové vazby (např. manganistanem), nebylo možno p53 reaktivovat. Souvislost mezi stupněm oxidace p53 a její reverzibilitou byla potvrzena elektrochemickou metodou.

Uplatnění nových poznatků molekulární biologie v primární protidrogové prevenci.
Marie Havelková

Je známo, že některé oblasti limbického systému mozku (zejména hippocampus, amygdala
a nucleus accumbens) jsou zodpovědny za pocity vyrovnanosti a vnitřního uspokojení jedince. Hlavním neurotransmiterem, který se v těchto procesech uplatňuje je dopamin. Limbický systém je snadno ovlivnitelný drogami. Požití drog vede vesměs ke zvýšenému vyplavení dopaminu a tím i k navození pocitu libosti. V současnosti se studuje 5 genů,
o kterých je známo, že determinují strukturu a hustotu dopaminových receptorů
v plazmamembráně neuronů. Nejznámnější je gen D₂, jehož lokus se nachází
na chromozómu č. 11. Gen D₂ může v alterovat ve 4 různých alelách: A₁, A₂, A₃ a A₄.
Frekvence alel A₃ a A₄ je v genofondu lidské populace velice nízká. Alela A₂ kóduje vznik normální (optimální) hustoty receptoru (vyskytuje se v genotypu asi 75% jedinců lidské populace), alela A₁ kóduje sníženou hustotu receptorových částic (a je obsažena
v genotypu asi 25% lidí). Alely A₂ a A₁ jsou ve vztahu neúplné dominance. Homozygoti A₁A₁ mají abnormálně nízkou dopaminergní aktivitu mozku a v důsledku toho pocit neustálé vnitřní tenze a osobního neuspokojení. Ochutnání jediné dávky drogy u nich vyvolá vyplavení dopaminu a v důsledku toho doposud nepoznaný pocit vyrovnanosti a uvolnění. Následuje pak silná, nezvládatelná touha zažít tento pocit uspokojení znovu. Tito jedinci jsou z hlediska vzniku drogové závislosti silně rizikoví. U homozygotů A₂A₂ je hladina dopaminu v mozku dostačující, proto nepociťují stavy neuspokojenosti a tenze. Droga
u nich nevyvolá onen nezapomenutelný zážitek uvolnění a blaha, jako u homozygotů A₁A₁. Heterozygoti_. A₁A₂ jsou - co do výše hladiny dopaminu v mozku i co do rizika vzniku závislosti - skupinou stojící uprostřed mezi oběma typy homozygotů. Důležité je, že vysoce rizikové homozygoty A₁A₁ lze poměrně jednoduše ”odkrýt”. Na EEG záznamu jejich mozku lze najít typické deformity tzv. vlny P300. Podle charakteru této vlny lze určit genotyp konkrétního jedince a tím zjistit, jak vysoké je riziko vzniku drogové závislosti, jestliže se setká s takovými vnějšími faktory, které vznik drogové závislost potencují (dostupnost a typ drogy, neúspěchy v osobním životě či v práci, kamarádi aj.). Bylo dále zjištěno, že alela A₁ se uplatňuje i při vzniku jiných typů závislostí, např. při vývoji obezity, která má svůj původ v neodolatelném nutkání k požití uhlovodanů (zejména čokolády), při silném kuřáctví a ve vývoji gamblerství.
Tyto poznatky molekulární biologie a genetiky jsou cenné zvláště proto, že umožňují selektivní a cílenou primární protidrogovou prevenci.

Oxid osmičelý v kombinaci s vhodným ligandem (pyridin, 2,2’ - bipyridin, 1,10 - fenantrolin) je používán jako strukturní sonda při studiu DNA již řadu let. Protože oxid osmičelý je elektroaktivní, lze použít různé elektrochemické metody pro studium aduktů DNA s těmito sondami.. V minulosti byly tyto adukty studovány na rtuťových elektrodách pomocí diferenční pulzní polarografie (DPP) a diferenční pulzní katodické rozpouštěcí voltametrie (DPCSV).

Na rtuťových elektrodách lze získat dva typy signálů aduktů DNA s komplexem oxidu osmičelého v závislosti na rychlosti posuvu potenciálu. Při vyšších rychlostech polarizace v  potenciálové oblasti od 0 V do –1,0 V jsou to tři faradayické signály odpovídající postupné redukci oxidu osmičelého. Použijeme - li nižších rychlost polarizace vzniká při potenciálu –1,2 V  signál katalytického charakteru. Tohoto katalytického signálu bylo použito pro velmi citlivé sledování modifikace nadšroubovicové DNA .

Rtuťové elektrody nejsou vhodné k přímé analýze reakční směsi DNA, oxidu osmičelého a ligandu bez dialýzy nebo etanolového přesrážení, neboť volný OsO₄ se na ně velmi pevně váže. K přímé analýze reakční směsi je možno použít elektrody z pyrolytického grafitu (PGE). Odstranit komplex oxidu osmičelého s 2,2’ – bipyridinem nebo 1,10 - fenantrolinem z  povrchu pracovní elektrody lze použitím řady různě polárních rozpouštědel. Tento typ pracovních elektrod byl úspěšně použit ke studiu modifikací polynukleotidů. Z průběhu závislosti signálu na době modifikace pro různé typy polynukleotidů je patrná silná preference střídavé A – T sekvence při modifikační reakci.

Hejátko Jan ^1,3, Lehnen Michaela ², Grosskopf Deborah ², Palme Klaus ² a Brzobohatý Břetislav ^1,3

Podstatou T-DNA inzerční mutageneze, efektivního nástroje funkční analýzy rostlinného genomu, je schopnost náhodné inzerce T-DNA, části Ti-/Ri-plazmidu, do rostlinného genomu a indukce inzerčních mutací (Koncz et al., 1992).

Při přípravě transgenních rostlin Arabidopsis thaliana pomocí inzerce rekombinantní T-DNA zprostředkované Agrobacterium tumefaciens došlo u jedné z transformovaných linií k vyštěpení zajímavého fenotypu vyznačujicího se retardací růstu, kroucením listů, chybění trychomů a především pak samčí sterilitou způsobenou chybami ve vývoji tyčinek. Pomocí metod T-DNA inzerční mutageneze jsme se pokusili identifikovat část genomu Arabidopsis thaliana, ekotyp Columbia 0, potenciálně zodpovědné za pozorované fenotypové odchylky.

Pro identifikaci genomové DNA sousedící s levou hranicí inzerované T-DNA jsme použili metodu ”plasmid rescue” (Koncz et al., 1992). Pomocí této metody se nám podařilo klonovat 220 bp dlouhý úsek genomové DNA se 100% homologií k nukleotidové sekvenci genu Nad7 lokalizovaném v mt DNA Arabidopsis thaliana a kódujícím sedmou podjednotku NADH-dehydrogenázy. Protože výsledek PCR nepotvrdil přítomnost odpovídajícího úseku Nad7 i v případě pravé hranice T-DNA, použili jsme pro identifikaci této části genomové DNA metodu inverzní PCR (reference v Koncz et al., 1992), pomocí níž se nám podařilo izolovat 200 bp dlouhý, dosud neznámý úsek genomu Arabidopsis thaliana. Hybridizací radioaktivně značených sond odvozených od obou klonovaných sekvencí s genomovou knihovnou IGF-BAC (Mozo et al., nepublikováno) jsme zjistili jednak přítomnost genu Nad7 v jaderném genomu a to zřejmě ve více kopiích (oproti jedinečnosti neznámé sekvence z pravé části T-DNA), jednak polohu na fyzikální mapě genomu Arabidopsis svědčící o relativně velmi velké vzájemné vzdálenosti (Mbp) obou sekvencí na intaktním chromozómu standardního typu. Kosegregační analýza prokázala kauzální souvislost pozorovaného fenotypu s recesivní inzerční mutací v části genomové DNA přiléhající k pravé hranici T-DNA. V současné době probíhá sekvenace této části genomu s cílem získat více informací o pravděpodobně kódující sekvenci zodpovědné za výše uvedené fenotypové odchylky.

Literatura:

Koncz, C., Schell, J. and Redei, G.P., 1992: T-DNA transformation and insertion mutagenesis. In: Koncz, C., Nam-Hai-Chua and Jeff Schell, (eds): Methods in Arabidopsis Research, World Scientific, 224-273

Petr Hodek

Technika fotoafinitního značení je významnou chemickou modifikační metodou sloužící ke studiu interakcí jak vysoko a nizkomolekulárních, tak dvou vysokomolekulárních vazebných partnerů vykazujících dostatečnou míru vzájemné vazebné afinity. Nejčastěji je fotoafinitní značení používáno k určení místa vazby nízkomolekulárního ligandu (substrátu nebo inhibitoru) na makromolekule akceptoru (enzymu). Tato technika vychází z principu afinitního značení s tím zásadním rozdílem, že ligand či jeho analog jsou naprosto chemicky nereaktivní až do okamžiku fotolytické aktivace. Fotolýzou fotolabilní skupiny ligandu, t.j. fotoafinitní sondy, vznikají reaktivní intermediáty ligandu, které umožní jeho kovalentní vazbu ve vazném místě akceptoru. Výhoda použití fotoafinitních sond spočívá především ve značné reaktivitě intermediátů, umožňující značit místa na proteinech s nízkou chemickou reaktivitou, a dále ve velmi krátké době života těchto intermediátů, což vede k minimalizaci vazby sondy mimo vazné místo.

Centrem našeho zájmu jsou cytochromy P-450, hemoproteiny, které metabolizují vedle endogenních také látky tělu cizorodé jako jsou např. léčiva, kontaninanty životního prostředí, potravní aditiva, kancerogeny. Jejich metabolickou přeměnou často dochází ke vzniku cytotoxických a i silně mutagenních derivátů původně neškodné sloučeniny. Navíc, studium úlohy těchto enzymů při metabolismu léčiv vede k objasnění deaktivace léčiv či vzniku jejich aktivní formy. Abychom pochopili funkci cytochromů P-450 (P450) v procesu metabolismu těchto sloučenin, je třeba studium soustředit na výzkum struktury a složení jejich aktivního centra. Poněvadž se předpokládá, že aktivní centrum cytochromů P-450 je tvořeno převážně hydrofobními (tedy velmi málo reaktivními) aminokyselinami, je fotoafinitní značení jednou z mála technik vhodných k jeho výzkumu.

Pro konstrukci fotoafinitních sond byla jako základ zvolena struktura léčiva, benzfetaminu, který je substrátem P450. Byly syntetizovány tři typy fotolabilních analogů benzfetaminu: i) monoazidoderiváty pro "volné" značení aktivního centra, ii) diazidoderiváty (síťující sondy) pro určení vzdáleností aminokyselin v aktivním centru a iii) aminoazidoderiváty (heterobifunkční sondy) pro mapování aminokyselin aktivního centra ve vzdálenosti dané délkou molekuly sondy od centrálního atomu železa hemu, na něž je sonda vázána jako šestý ligand svou aminoskupinou. Všechny fotoafinitní sondy vykazovaly velmi dobré vlastnosti jak při interakci s P450, tak z fotochemického hlediska - poločasy rozpadu 2-3 sekundy při ozařování světlem 254 nm. Při použití tritiem značeného diazido-sondy byly po štěpení značeného P450 trypsinem a následné HPLC separaci radioaktivně značených štěpů identifikovány dvě dvojice peptidů aktivního centra kovalentně propojené sondou. Podobně byl aplikací aminoazido-sondy za použítí LysC proteinázy pro štěpení značeného P450 v kombinaci s přímou analýzou směsi peptidů technikou MALDI-TOF nalezen další peptid aktivního centra P450 v definované vzdálenosti od hemu. Tyto výsledky mapování P450 fotoafinitními sondami ve spojení s teoretickými modely struktury těchto enzymů umožní odhalit architekturu aktivního centra P450 a pochopit tak jeho úlohu v procesu metabolismu léčiv a aktivace kancerogenů.

Horová Lucie¹, Zemanová Karla¹, Bryja Josef¹, Šmardová Jana ², Ševčíková Sabina¹, Vodička Petr¹, Kohoutek Jiří¹ a Šmarda Jan¹

Kyselina retinová a další příbuzné deriváty vitaminu A se podílejí na řízení rozmanitých biologických procesů. Např. ovlivňují morfogenezi embrya, buněčnou proliferaci, diferenciaci a také maligní transformaci. Své funkce kyselina retinová realizuje prostřednictvím dvou typů jaderných receptorů, které patří do rodiny příbuzných proteinů, fungujících jako ligand-dependentní transkripční faktory. Jsou to jednak receptory pro kyselinu retinovou (RARa , RARb a RARg ) a receptory pro retinoid X (RXRa , RXRb a RXRg ). Zatímco proteiny RAR vážou all-trans i 9-cis izomer kyseliny retinové, proteiny RXR vážou pouze 9-cis izomer kyseliny retinové. Existuje řada důkazů, že retinoidové receptory zasahují do nádorotvorných procesů. Např. (1) u mnoha typů nádorů je popsáno snížení exprese RAR a RXR; (2) prostřednictvím dominantně negativní formy RARa exprimované v buňkách kostní dřeně lze vyvolat zastavení diferenciace myeloidních buněk in vitro a in vivo; (3) lokus RARa je postižen translokací t(15; 17) u pacientů s akutní promyelocytární leukémií. V naší laboratoři jsme popsali, že retinoidové receptory suprimují transformační účinek onkogenu v-myb viru ptačí myeloblastózy, který způsobuje akutní monoblastickou leukémii u kuřat a transformuje myelomonocytické buňky in vitro. Prokázali jsme, že exprese RAR i RXR v monoblastech transformovaných onkogenem v-myb zastavuje jejich proliferaci ve fázi G₁ cyklu a umožňuje dokončení diferenciace do konečného stádia makrofágů. Prokázali jsme, že inhibiční vliv retinoidových receptorů na onkoprotein v-Myb spočívá v jejich schopnosti podstatně snížit účinnost, s jakou v-Myb aktivuje transkripci reportérských genů i svých přirozených cílových genů v buňkách. Ze srovnání protinádorových účinků proteinů RAR a RXR na onkoprotein v-Myb vyplývá, že protein RAR suprimuje v-Myb účinněji než RXR a pravděpodobně se oba receptory odlišují v mechanismu, kterým oba typy receptorů supresi onkoproteinu v-Myb vyvolávají.

Jiří Hudeček¹, Pavel Anzenbacher², Peter Hildebrandt³, Andrew W. Munro⁴

Metodou rezonanční Ramanovy spektroskopie s vysokým spektrálním rozlišením (1-2 cm^-1) při excitaci do Soretova absorpčního pásu (?_exc= 413 nm) byly studovány následující izoformy cytochromů P450: lidské rekombinantní cytochromy P450 3A4 a 1A2 (jako zástupci skupiny mikrosomálních enzymů, tj. integrální membránové proteiny) a rozpustný bakteriální P450 BM-3 (CYP 102) z Bacillus megaterium jako modelový protein (jehož prostorová struktura je známa [1]). Tento P450 protein obsahuje vedle hemové (P450) domény ještě reduktasovou (flavoproteinovou) část; studována byla jak izolovaná hemová doména, tak holoprotein. Pro všechny studované proteiny byla získána spektra (v intervalu Ramanových posuvů 300-1700 cm^-1) pro enzym v základním stavu (oxidovaný, bez přídavku substrátu, "resting state"), po redukci dithioničitanem sodným a po přidání substrátu (resp. inhibitoru). Stejnou metodou byl studovám také mutantní holoprotein CYP 102 W96Y.

V základním stavu dominuje ve spektrech všech studovaných P450 Ramanův pás ?₄ při 1370-1371 cm-1, tj. v pozici typické pro koordinaci hemového železa thiolátem [2] a spektra jsou si navzájem dosti podobná. Určité rozdíly mezi nimi i ve vztahu k již dříve publikovaným spektrálním údajům o dalších izoformách P450 [2, 3, 4] se vyskytují zejména v oblasti 1600-1640 cm^-1 a lze je připsat odlišnostem v interakci vinylových skupin hemu s apoproteinem.

Při vazbě substrátu (inhibitoru) jsou ve spektrech pozorovatelné změny spinového stavu a koordinace hemového železa a také změny v poloze nebo relativní intenzitě Ramanových pásů vinylů; rozsah a charakter těchto změn je pro jednotlivé studované formy poněkud odlišný. Nejpravděpodobnější interpretace těchto výsledků ukazuje na rozdíly v interakci mezi hemem (zejména postranními řetězci hemu) a jeho proteinovým okolím a také na odlišnosti v koordinaci hemového železa v základním stavu (možný vliv přítomnosti molekul vody v aktivním místě) .

Literatura:

1. Ravichandran KG, Boddupali SS, Hasemann CA, Peterson JA, Deisenhofer J (1980) Science 261, 731-736.

2. Anzenbacher P, Evangelista-Kirkup R, Schenkman J, Spiro TG (1989) Inorg. Chem. 28, 4491-4495.

3. Hildebrandt P, Greinert R, Stier A, Taniguchi H (1989) Eur. J. Biochem. 186, 291-302.

4. Wells AV, Li P, Champion PM, Martinis SA, Sligar SG (1992) Biochemistry 31, 4384-4393.

Jelen František¹, Tomschik Miroslav^1,2, Fojta Miroslav¹, Havran Luděk¹, Trnková Libuše², Paleček Emil¹

Peptidová nukleová kyselina (PNA) je potenciálním farmakem v genové terapii a analogem DNA, který má některé vlastnosti shodné s DNA, zvláště vázat se silně a specificky ke komplementárnímu řetězci DNA. Na rozdíl od DNA její molekula nemá elektrický náboj. Ke studiu redukčních a oxidačních signálů jednořetězcových dekamerů a pentadekamerů PNA a DNA se stejnou sekvencí jsme použili cyklické (CV) a square-wave voltametrie (SWV). Signály, které poskytovaly DNA oligomery na visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE), t.j. katodický pík CA (redukce cytosinu a adeninu) a anodický pík G (oxidace redukčního produktu guaninu) odpovídaly těm signálům, které byly dříve získány u jednořetězcové chromosomální a plasmidové DNA. U všech PNA oligomerů jsme pozorovali analogické chování, avšak potenciály píků byly negativnější ve srovnání s DNA oligomery. Popisované píky byly studovány pomocí adsorptivní rozpouštěcí voltametrie v závislosti na době akumulace, koncentrace oligomeru a některých parametrech elektrochemických měření. Mezi DNA a PNA byly pozorovány jak shody, tak rozdíly. Byl nalezen vztah mezi obsahem guaninu a sekvencí bazí na jedné straně a elektrochemickou odpovědí na druhé straně. Pík G u PNA oligomerů při době adsorpce 1 min vykazoval lineární závislost až do koncentrací asi 500 ng/ml; limit detekce při době adsorpce byl nižší než 5 ng/ml. Adsorpční chování PNA molekul v slabě alkalickém prostředí bylo studováno pomocí a.c. voltametrie a byl zjištěn značný rozdíl mezi chováním DNA a PNA molekul. Analýza derivační rozpouštěcí chronopotenciometrickou technikou za konstantního proudu (CPSA) poskytovala na pyrolytickém grafitu dva dobře rozlišitelné píky guaninových a adeninových zbytků. CPSA píky u PNA, ve srovnání s DNA, byly nižší, t.j. obráceně než tomu bylo u voltametrických metod na HMDE, kde anodické píky PNA byly vždy vyšší než píky DNA s odpovídající sekvencí bází jak u při plném, tak při neúplném pokrytí elektrody. Domníváme se, že rozdíl v redukčních a oxidačních signálech u PNA a DNA byl pravděpodobně způsoben rozdílnými adsorpčními vlastnostmi těchto sloučenin. Pomocí SWV a a.c. voltametrie s použitím přenosu elektrody ze zkoumaného roztoku do základního elektrolytu jsme analyzovali DNA-DNA a PNA-DNA duplexy i směs PNA a DNA molekul.

Kašpárek Petr¹, Hobza Roman¹, Kizek René¹, Pantůček Roman¹, Růžičková Vladislava¹, Hájek Václav², Rosypal Stanislav¹, Doškař Jiří¹

Kmeny Staphylococcus aureus rezistentní k oxacilinu způsobují závažné nozokomiální infekce. V práci byla stanovena genotypová varibilita u 26 kmenů izolovaných v letech 1996-97 z nemocnic v České republice (Praha, Brno, Olomouc, Plzeň, Trutnov). Ke studiu byla zvolena metoda makrotrestrikční analýzy genomové DNA pomocí pulzní gelové elektroforézy, hybridizace restrikčních spekter DNA se specifickými sondami, polymerázová řetězová reakce (PCR) a analýza obsahu plazmidů. SmaI-makrorestrikční analýzou genomových DNA bylo u studovaných kmenů identifikováno 11 odlišných elektroforetických typů. Hybridizace SmaI- a EcoRI-restrikčních spekter se sondou specifickou pro S. aureus připravenou z SmaI-44 kb restrikčního fragmentu poskytla DNA-fingerprinty charakteristické pro jednotlivé elektroforetické typy umožňující přesnější typizaci studovaných kmenů. Pomocí specifických primerů byla PCR reakcí amplifikována část genu kódujícího koagulázu za vzniku amplifikačního produktu o velikosti 750 bp, jehož štěpením restriktázou AluI byly získány dva odlišné restrikční profily využitelné pro typizaci kmenů. PCR reakce byla též využita k důkazu přítomnosti genu mecA zodpovídajícího za rezistenci k oxacilinu. Amplifikační produkt o velikosti 300 bp nevykázal u studovaných genů restrikční polymorfismus. U 4 kmenů citlivých k tetracyklinu byla prokázána přítomnost plazmidu o velikosti 35 kb, jehož fenotypový projev byl stanoven po transdukci do bezplazmidového kmene a eliminaci z výchozích kmenů. Plazmid zodpovídá za rezistenci k penicilinu, etidium bromidu a iontům kadmia a rtuti. Lze konstatovat, že použité genotypizační metody představují vhodný prostředek ke studiu variability genomu stafylokoků a umožňují vzájemné odlišení kmenů izolovaných z různých zdrojů.

Kizek René¹, Koutník Vilém², Šimek Jaroslav² a Kourek Radek²

Selen je stopový prvek, který doprovází síru v řadě látek. Některými svými vlastnostmi připomíná síru a také vytváří sloučeniny obdobného charakteru, a to od nejjednodušších anorganických až po biochemicky významné látky. Například lze uvést selenové analogy siřičitanů, síranů, sirných aminokyselin, koenzymu A a dalších. Selen byl objeven v roce 1818, jeho přítomnost v rostlinách byla poprvé prokázána v roce 1932 a jako nezbytný nutriční faktor pro živočišný organismus byl stanoven v roce 1957. Později se ukázalo, že tento prvek je nezastupitelný rovněž pro lidský organismus. Selen je významným elementem v otázkách zdravotního stavu člověka a je nutnou součástí jeho výživy. Nedostatek selenu ve stravě a následně v organismu člověka se začal dávat do příčinné souvislosti s některými chorobami. Výzkumy ukazují, že u lidí s nižší hladinou selenu v krvi je prokazatelně vyšší výskyt srdečních a cévních chorob, včetně infarktu myokardu, více virových onemocnění a vyšší výskyt nádorů. Významná je skutečnost, že efekt zájmového prvku spočívá v prevenci, nikoliv v léčbě. Vlastní biochemický mechanismus ochranného účinku není ještě zcela objasněn. Víme ale, že selen zvyšuje účinnost těch enzymů v organismu, které v něm eliminují škodlivé látky. Například enzym glutathionperoxidasa odstraňuje z organismu toxické kyslíkaté radikály, které mohou iniciovat zhoubná onemocnění. Právě selen zvyšuje aktivitu tohoto enzymu. Pozitivní vliv vyšších koncentrací selenu může být podpořen přítomností dostatečných hladin vitamínů, zejména skupiny A,E a C. V tomto smyslu může zelenina sehrát významnou roli, neboť ve výživě člověka je zdrojem mimo jiné právě selenu a vitamínů. Nutno však upozornit, že obsahy selenu v zelenině jsou závislé od koncentrace tohoto prvku v půdě. Česká republika, podobně jako další evropské země (Rakousko, Německo, Holandsko, Švýcarsko, Švédsko, Finsko) mají nízké obsahy selenu v půdách, proto se přistupuje k suplementaci selenu, například aplikací selenu do systému půda-rostlina. Cíleně s maximální přesností lze tak činit právě u zeleniny.

Dostatečný vstup selenu do lidského organismu lze zajistit výběrem vhodné zeleniny či možnou suplementací v rámci aplikace selenu do systému půda-rostlina. Tím se zvýší obsah selenu v produktech a navíc se tento obohatí o další biologicky aktivní látky jako příklad uveďme vitamín C či fytoncidní látky. Podobný efekt byl pozorován u brambor a změně obsahu aminokyselin.

Selen spolu s vitamínem C, ale i dalšími, např. vitamínem E se řadí mezi antioxidanty mající schopnost eliminovat volné radikály, např. superoxid. Nutriční hodnota takové zeleniny je výrazně vyšší. To platí i u česneku a cibule. Mikrobiologický terčíkový test ukázal, že selen má schopnost stimulovat fytoncidní aktivitu. Fytoncidní účinek je dán obsahovými látkami, jejichž chemická podstata je tvořena sulfidy, disulfidy a trisulfidy, zastoupené například dialylsulfidem, dialyldisulfidem a dialyltrisulfidem.

Klánová Jana

Fragmentační analýza DNA je podobně jako automatické sekvenování založena na selektivní PCR amplifikaci DNA, následné kapilární elektroforéze vzorků a konečně detekci fluorescenčně značených fragmentů laserem. Zatímco při sekvenační analýze však za pomoci jediného primeru generujeme značené fragmenty všech délek a s jejich pomocí určujeme kompletní pořadí bazí v sekvenci, při fragmentační analýze nás zajímá nikoli pořadí bazí, ale jen velikost daného fragmentu, jeho kvantita, případně změna pohyblivosti při elektroforéze. Využíváme tedy klasické PCR amplifikace se dvěma primery, z nichž jeden je fluorescenčně značený. Volba dalších podmínek závisí na konkrétní aplikaci.

Široké uplatnění má tato metoda při analýze mikrosatelitních markerů. Provedeme-li PCR amplifikaci těchto polymorfních oblastí a vzniklé fragmenty analyzujeme elektroforetickou separací podle velikosti, získáme efektivní nástroj k určení lidské či zvířecí identity, ke studiu dědičných linií či konstrukci genetických map. Mimo to se fragmentační analýza začíná prosazovat v nádorové diagnostice. Srovnání výsledků fragmentace vzorků ze zdravé a nádorem zasažené tkáně téhož jedince poskytuje cenné údaje při studiu LOH (Loss of Heterozygozity, ztráta heterozygozity) a RER (Replication Error, replikační chyba).

AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism,délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentů) je aplikace, která odstraňuje některé nevýhody klasických metod, jako je RFLP či RAPD. Po štěpení restrikčními endonukleázami se na lepivé konce vzniklých fragmentů ligují dvouvláknové adaptory, které dají vzniknout templátu pro neselektivní či selektivní PCR amplifikaci. Při minimální náročnosti na množství výchozí DNA a bez nutnosti předběžné znalosti sekvence lze takto vizualizovat stovky restrikčních fragmentů.

Na schopnosti jednovláknové DNA zaujímat za nedenaturačních podmínek stabilní trojrozměrné konformace je postaven SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism, jednovláknový konformační polymorfismus). Změna jediného nukleotidu v sekvenci může způsobit změnu prostorového uspořádání, která je detekovatelná jako změna elektroforetické mobility.Mutace se tedy vyhledává na základě změny pohyblivosti studovaného fragmentu oproti divokému typu.

Výraznou předností fragmentační analýzy na automatickém genetickém analyzátoru je fluorescenční značení fragmentů, které odstraňuje práci s radioaktivitou a zároveň systémem čtyř barev umožňuje souběžnou analýzu několika vzorků. Rychlost a reprodukovatelnost výsledků, možnost automatického sběru a vyhodnocení dat a minimální množství potřebné DNA jsou dalšími výhodami oproti klasickým metodám.

Pro své unikátní vlastnosti je PNA (Peptide Nucleic Acid, peptidonukleová kyselina) velkým příslibem pro molekulární biologii, diagnostiku a výzkum antisense terapeutik. PNA imituje strukturním uspořádáním bazí řetězec DNA, ale ribosafosfátový skelet je nahrazen peptidem. Důležitým rysem tohoto polymeru je vysoká termostabilita; T_m PNA/DNA duplexu je vyšší asi o 1º C na každý pár bazí než u DNA/DNA duplexu. Na rozdíl od DNA/DNA, T_m duplexů PNA/DNA téměř nezávisí na iontové síle. PNA vykazuje vyšší specificitu než DNA. Neutrální peptidový skelet dovoluje PNA sondě snadno penetrovat do chromozómů, kdežto negativně nabitá DNA se váže pouze k jejich povrchu. Polyamidový skelet s purinovými a pyrimidinovými bázemi po stranách není rozpoznáván nukleasami, ani proteasami. PNA je stabilní v širokém rozsahu pH.

PNA preferuje tvorbu duplexu v antiparalelním směru. PNA oligonukleotidy jsou obvykle 12 až 15 bazí dlouhé. Při navrhování sekvence je třeba sledovat obsah purinů vzhledem k tendenci polymeru agregovat. Při značení (fluorescein, rhodamin, biotin aj.) je nutné vložit hydrofilní můstek. Modifikující aminokyseliny mohou být inkorporovány na kterémkoli konci nebo uvnitř řetězce. Při syntéze je C- terminální monomer (analogický 3´- koncovému monomeru u DNA) navázán k speciální polymerní matrici a další monomery jsou postupně připojovány v cyklech. Syntéza může být adaptována pro oligonukleotidové syntetizátory, jejichž provoz je ekonomičtější než drahá klasická syntéza peptidů.

Mezi nejčastější aplikace PNA patří identifikace bodových mutací (v jediném kroku, bez DNA sekvenování), užití PNA jako hybridizační sondy (podstatná redukce hybridizačního času, větší volnost ve volbě podmínek, nižší pozadí), elektrochemické biosensory pro detekci bodových mutací, purifikace DNA za přítomnosti PNA (hybridizace k afinitně značené PNA). Rezistence k enzymové degradaci a vysoká specificita předurčují PNA oligonukleotidy k roli potenciálních antisense léčiv.

PNA je využívána komerčně zejména k diagnostice a monitoringu. Firma PNA Diagnostics vlastní exkluzivní licenci, kterou poskytuje firmám Boehringer Mannheim (užití PNA pro automatizovanou in vitro diagnostiku), Cytocell Limited (detekce chromozomálních abnormalit) a Biocom (bakteriální monitoring potravin). DAKO Diagnostics používá PNA sondu pro detekci infekce EB virem. PE Biosystems, divize firmy Perkin-Elmer, vlastní licenci pro výrobu a prodej PNA monomerů a oligomerů a vyrábí syntetizátor oligonukleotidů Expedite 8909, který může být použit k syntéze PNA.

Matej Lexa¹, John M. Cheeseman²

V předcházejících pokusech jsme studovali vliv lokalizace nitrátreduktázy v rostlině na růst štěpenců hrachu A317 s nízkou hladinou tohoto enzymu a divokého typu, odrůdy Juneau. Výsledky ukázaly, že lokalizace měla jen malý vliv na celkový růst, změnila však umístění dusičnanů v rostlině. Používání techniky štěpení má své nedostatky - je pracná, vytvořené chiméry trvají pouze jednu generaci a není zcela vyloučen nežádoucí vliv mechanického zásahu na rostlinné procesy. Proto jsme se rozhodli vyzkoušet alternativní možnost jak ovlivnit lokalizaci nitrátreduktázy v rostlinách. Transformovali jsme Arabidopsis pomocí cDNA nitrátreduktázy tabáku (nia2), která byla umístěna pod kontrolu orgánově specifických promotorů a konstitutivního promotoru CaMV35S. Pro transformaci jsme použili mutantní Arabidopsis s nízkou aktivitou nitrátreduktázy a běžný ekotyp Columbia. Uvedenou transformací jsme získali jen několik málo rostlin se zvýšenou aktivitou enzymu. Častým výsledkem transformace však bylo snížení aktivity u obou typů rostlin, pravděpodobně působením kosuprese mezi vneseným a původním genem nitrátreduktázy. Kromě zvýšeného a zníženého růstu u transformovaných mutantů se změněnou aktivitou nitrátreduktázy jsme pozorovali několik dalších fenotypů: chlorotické listy a změny v apikální dominanci a ve větvení květních stonků.V současnosti pokračuje práce na charakterizování vybraných linií transformantů.

Matej Lexa¹, John M. Cheeseman²

Mezi rostlinnými druhy, ale taky rostlinami rostoucími v odlišných podmínkách, existují často značné rozdíly v místě asimilace dusičnanů. Zatímco rostliny vyskytující se v půdách s vysokým obsahem dusičnanů asimilují podstatnou část přijatých dusičnanů v nadzemních částech, některé dřeviny a druhy z klimaxových ekosystémů asimilují dusičnany převážně v kořenech. Důvody pro takové rozdíly a jejich evoluční význam pro jednotlivé druhy však nejsou známy. Otázce umístění nitrátreduktázy a dalších asimilačních enzymů v rostlinách často není věnována dostatečná pozornost. Tak například většina matematických modelů příjmu živin a růstu, které rozdělují rostlinu na nadzemní a podzemní část, předpokládá stoprocentní asimilaci dusíku v kořenech. V této práci jsme ukázali, že simulační modely poskytnou po přemístění asimilace z kořenů do listů naprosto odlišné výsledky. Teoreticky odvozené rozdíly jsme se pokusili reprodukovat u živých rostlin. K tomu jsme použili mutant hrachu A317 s nízkou hladinou nitrátreduktázy a jeho divoký typ, odrůdu Juneau. Vzájemným štěpením těchto dvou genotypů jsme získali rostliny s nitrátreduktázou převážně v kořenech nebo listech, popřípadě kontrolní rostliny s nízkým nebo vysokým obsahem nitrátreduktázy. Růstové pokusy se štěpenci ukázali, že umístění nitrátreduktázy mělo jen malý vliv na celkový růst, podstatně však změnilo umístění dusičnanů v rostlině. Při vysokém obsahu dusičnanů v hydroponickém roztoku byl nedostatek nitrátreduktázy v listech příslušného druhu štěpenců kompenzován zvýšenou aktivitou nitrátreduktázy v kořenech. Opačný efekt nebyl pozorován. Pokusy ověřily systém štěpení, pomocí kterého je možné vcelku jednoduchým způsobem studovat některé další zajímavé problémy z oblasti fyziologie rostlin. Do úvahy přichází například netradiční přístup k otázce možnosti transportu dusičnanů z nadzemních do podzemních částí nebo pohybu molekulárních signálů mezi nadzemní a podzemní částí rostlin.

Styren oxid (SO), hlavní metabolit styrenu, reaguje s nukleofilními centry biologických makromolekul, včetně bílkovin a DNA. V poslední době jsme syntetizovali a charakterizovali celou škálu guaninových a adeninových adduktů, vzniklých reakcí SO s purinovými nukleotidy. Reakcí SO s 3´-dGMP vznikají isomerní N-7-, N²-, N-1- a O⁶-(2-hydroxy-1 či 2-phenylethyl)-2´-deoxyguanosin-3´-monofosfáty, kdežto reakce s 3´-AMP vede ke vzniku isomerních N-1- a N⁶-(2-hydroxy-1 či 2-phenylethyl)-deoxyadenosin-3´-monofosfátů. Hlavními produkty reakce DNA in vitro se styren oxidem jsou a a b N-7 guaninové addukty styrenu (93% celkové alkylační hladiny), zatímco isomerní N-3 adeninové addukty styrenu se tvoří v mnohem menší míře (4% celkové alkylace). N-7 guaninové i N-3 adeninové addukty jsou labilní a snadno spontánně depurinují.

Předpokládá se, že DNA addukty představují primární poškození DNA a jsou prvním krokem v chemické mutagenese a karcinogenese. Bylo prokázáno, že O⁶-addukty guaninu jsou premutagenním poškozením a vedou ke vzniku GC-AT transice. V experimentech na lidských T-lymfocytech, ovlivněných in vitro SO, jsme detekovali zvýšené hladiny styrenových O⁶-adduktů guaninu, avšak molekulární analýza mutací odhalila převahu bázových substitucí GC-TA a AT-TA. Zdá se, že v mutagenese vyvolané styrenem se budou spíše uplatňovat addukty adeninu nebo thymidinu. Výše zmíněné mutace lze též vysvětlit značnou labilitou a depurinací N-7 guaninových a N-3 adeninových adduktů. V průběhu replikativního by-passu je adenin inkorporován do protilehlého řetězce DNA oproti apurinnímu místu.

Hrachová aminoxidasa (pea seedling amine oxidase, EC. 1.4.3.6.; PSAO) katalyzuje oxidační deaminaci aminů na příslušné aldehydy, peroxid vodíku a amoniak. Za fyziologické substráty PSAO jsou považovány diaminy putrescin a kadaverin, dekarboxylační produkty odvozené od ornithinu resp. lysinu. Příslušné aminoaldehydy vzniklé jejich enzymovou přeměnou spontánně cyklizují na D ¹-pyrrolin resp. D ¹-piperidein a mohou být prekurzory mnohých alkaloidů (sedaminových, lobeliových, pyrrolicidinových, tropanových a dalších).

Široká substrátová specifita a dlouhodobá stabilita PSAO předurčují tento enzym k průmyslovému využití v různých biosyntetických procesech. Cílem naší studie byla možnost zapojení tohoto enzymu do syntézy jedné z přírodních látek, u níž izolace z přirozeného zdroje nedosahuje dostatečných výtěžků a jejíž chemická příprava bývá složitá.

Chemických metod syntézy benzylisochinolinových alkaloidů existuje celá řada[1]. Kritickým místem přípravy je syntéza vlastního benzylisochinolinového skeletu molekuly. Obvyklou nevýhodou chemických metod je taktéž nutnost chránit či blokovat ostatní funkční skupiny před nežádoucími vedlejšími reakcemi, což do značné míry snižuje celkové výtěžky produktů. Zde se otvírá možnost zapojení enzymů do syntetických procesů a využití jak jejich schopnosti uskutečnit reakce, jinak obtížně proveditelné, tak jejich substrátové specifity pro cílené usměrnění dějů.

Schopnost hrachové aminoxidasy deaminovat různé biogenní i syntetické aminy a současně snadná reakce aldehydů s aminy, vedla k myšlence enzymově zkrátit chemickou syntézu papaverinu s použitím jediného organického prekurzoru, homoveratrylaminu. Již v roce 1930 syntetizovali Späth and Burger [2] tetrahydrobenzylisochinolinovou strukturu tzv. ”biogenní” cestou, kdy Pictet-Spenglerovou kondenzací homoveratrylaminu s homoveratraldehydem za pokojové teploty připravili N-norlaudanosin (tetrahydropapaverin). Za účasti PSAO, která přeměňuje homoveratrylamin na homoveratraldehyd, by bylo možno očekávat následující reakční schéma přípravy tetrahydropapaverinu jako dalšího prekurzoru:

[1] The Plant Alkaloids (T.A.Henry, ed.), J.& A. Churchill Ltd., London 184-186 (1949).

A method has been developed for single-step native purification of hexahistidine-tagged maize cytokinin-glucoside-specific b -glucosidase (Zm-p60), overexpressed in E. coli strain. The POROS MC/M perfusion chromatography resin charged with zinc ions was successfully used for rapid metal chelate affinity purification of recombinant (His)₆Zm-p60. The availability of highly purified protein facilitates studies on its catalytic properties, substrate specifity and structural and functional domains, too.

For isolation of insoluble forms of Zm-p60 single-step purification under denaturing conditions followed by matrix-assisted refolding was designed. However, the refolding yield was quite low, the kinetic parameters and electrophoretic mobility of refolded form of wild type Zm-p60 were compared with parameters of enzyme purified under native conditions. Properly folded form characteristics were found to be equal to characteristics of native form.

These studies were supported in part by a research grant from the Czech Ministry of Education No. VS 96096 and in part by the grant of the Grant Agency of the Czech Academy of Science No. A 5004603.

Hrstka Roman, Růžičková Vladislava

Genome DNA of 26 Staphylococcus aureus strains was cleaved with the restriction endonuclease SmaI. Obtained fragments were separated by pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Obtained SmaI restriction patterns was evaluated by comparison analysis (UPGMA). On the basis of the made dendrogram, it was possible to determine 20 different electrophoretic types. Strains were divided according to SmaI restriction patterns based on the level of similarity83,5-100 % into 8 type groups TS₁ - TS₈. From this analysis it is obvious that SE-
-positive strains are not identical with the TSST1 positive strains.

In connection with classification of the studied strains into type groups, several phenotypic characteristic were tested. A certain correlation between the production of delta haemolysins and strains belonging to TS₄ group was found.

Since the set of the studied strains contained 19 TSST-1-positive strains of
S. aureus, a PCR reaction was set up with the use of specific tst primers. PCR reaction was positive for 17 strains (the size of the PCR fragment was about 390 bp), and only two strains (96/89 and 96/90) were negative. After restriction analysis of the obtained PCR fragment, a specific restriction site for restriction endonuclease HaeIII was found (size of fragments was 250 and 140 bp).

For detailed characterization of TSST-1-positive strains, a specific marked PCR product was used for dot blot analysis with genome staphylococcal DNA. The result was positive for all S. aureus strains except for strain 5756 (SEA-positive). For other strains the reaction was negative what can be important for S. aureus identification.

Further, I have tried to localize specific sequences of the tst gene. Using hybridization, a positive signal was found for majority of the TSST-1-positive strains with fragment sizes of about 170 and 105 kbp. For the strain 5757 (SEB-
-positive), a weak positive signal with the fragment size of about 415 kbp was found.

When comparing RFLP and PCR methods, it is necessary to point out that RFLP is a method suitable especially for typing of S. aureus isolates. However, its sensitivity must be increased by hybridization. For quick and reliable identification of TSST-1 strains, PCR reaction, with the use of certain specific primers, seems to be more suitable.

Vojtíšková M., Kadlecová J., Ravčuková B., Valášková I., Burešová H., Gaillyová R.

Cystická fibróza (CF) patří mezi nejčastější autosomálně recesivní dědičné metabolické poruchy, které se projevují převážně nedostatečnou pankreatickou funkcí. Frekvence CF je u živě narozených dětí 1:2000. Výskyt nositelů (heterozygotů) patologické alely v populaci je 1:25. Gen pro cystickou fibrózu CFTR (cystic fibrosis transmembrane condunctance regulator) byl lokalizován na chromosomu 7q31.1, klónován a sekvenován (Kerem B. et al.,1989, 245,1073 -1080). CFTR gen ( 27 exonů) kóduje transmembránový protein, který vytváří cyklickým AMP-regulovaný chloridový kanál. Redukce nebo ztráta funkce kanálu stejně jako defektní acidifikace intracelulárních kompartmentů v CF epitelu jsou zodpovědné za klasické CF symptomy a za vznik onemocnění charakterizovaného dysfunkcí exokrinních žláz s vysokou koncentrací elektrolytů v potu a s nápadnou vazkostí hlenovitých sekretů. V 5 – 10% případů se onemocnění manifestuje již u novorozenců mekoniovým ileem. V dětství jsou typická postižení gastrointestiální a respirační. U dospělých mužů se může projevit kongenitální absence vas deferens . Závažnost a široká variace v manifestaci cystické fibrózy u pacientů souvisí zejména s typem a polohou mutací v CFTR genu s následným ovlivněním patologické funkce CFTR proteinu. Dosud bylo v genu CFTR identifikováno přes 700 mutací, z nichž nejčastější mutace dF508 se vyskytuje až v 70% případech těžkých CF pacientů. Test na soubor 12 mutací dovolí zachytit více jak 80 procent mutací, vyskytujících se u CF pacientů v ČR ( Macek a kol. osobní sdělení, prosinec 1998).

Soubor 34 CF pacientů z jihomoravského regionu byl v letech 1993 – 98 vyšetřen přímou analýzou na soubor 14 mutací v CFTR genu. Výsledek vyšetření 68 patologických CF alel prokázal v 72% mutaci dF508, v 7,3 % mutaci G542X, ve 3% mutaci G551D, v 1,5% mutaci N1303K a mutaci 3849+10kbCtoT. Celkem bylo identifikováno 86% mutací, způsobujících patologický fenotyp u pacientů. U 33 CF pacientů byla identifikována mutace dF508, z toho 16 homozygotů s genotypem dF508/dF508, 3 pacienti s genotypem dF508 /G542X, 2 s genotypem dF508/G551D, 1 s genotypem dF508/N1303K, 1 s genotypem dF508/3849+10kb CtoT, u zbývajících 10 pacientů s těžkým průběhem CF byla identifikována mutace dF508 na jedné alele, druhá mutace ( nezahrnutá v souboru 14 testovaných mutací) je dovyšetřována souborem vyhledávacích metod mutační analýzy, SSCP a DGGE s následující sekvenací. V našem souboru jeden pacient (M.K. 1998) byl homozygotním nositelem mutace G542X s vážným klinickým stavem již po narození, s klinickou CF diagnosou stanovenou v průběhu prvních třech měsíců života a potvrzenou na molekulární úrovni vyšetřením genotypu G542X/G542X. V rodinné anamnéze se CF nevyskytovala.

Mutační analýza  genu CFTR a polymorfní variace homopyrimidinové sekvence 5T v intronu 8, způsobující chybný sestřih se ztrátou exonu 9 v mRNA a mající potenciální vztah k patologii CBAVD vzhledem k blokádě transportu spermatozoí z testikulárních struktur do genitálního traktu, projevující se azoospermií (S.Larriba et al. Hum. Mol. Genet. 1998,7,1739 –1744) byla sledována na andrologicky a cytogeneticky vybraném souboru 45 mužů s poruchou reprodukce. Získané výsledky analýzy patologie CFTR genu prokázaly zvýšenou frekvenci 8,8% heterozygotů na mutaci dF508. V 15,5% případů záchyt 5T alely v intronu 8 u vyšetřených sterilních mužů podporuje hypotézu o pravděpodobné roli CFTR genu pro normální vývoj vas deferens a současně poukazuje na zatím neobjasněnou úlohu CFTR genu v procesu spermatogeneze.