STANOVENÍ ENZYMOVÉ AKTIVITY ALKALICKÉ FOSFATASY

Stanovení enzymové aktivity alkalické fosfatasy

Alkalická fosfatasa v séru pochází především z kostní tkáně (osteoblastů) a mikrosomů jaterních buněk, její aktivita v séru stoupá v důsledků nemocí těchto orgánů. Jako jeden z mála enzymu je alkalická fosfatasa vylučována žlučí do trávicího traktu, její zvýšená hladina v séru tedy může indikovat sníženou průchodnost žlučových cest (cholestasis). Aktivita tohoto enzymu se určuje nejčastěji na základě jeho schopnosti štěpit syntetický substrát p-nitrofenylfosfát, produkt p-nitrofenol má intenzivní žluté zbarvení.

Změřte aktivitu alkalické fosfatasy několika níže uvedenými způsoby současně posuďte vliv aktivátoru a inhibitoru.

Reagencie:

roztok 1: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát v glycinovém pufru

roztok 2: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát + 1 mM MgSO₄ v glycinovém pufru

roztok 3: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát + 0.1 M KH₂PO₄ v glycinovém pufru

1. Dvoubodové stanovení

Postupujte podle následujícího schématu :

	vzorek	blank
roztok substrátu (roztok 1) sérum	1 ml 0.1 ml	1 ml -
inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě
0.02 M NaOH	10 ml	10 ml
sérum	-	0.1 ml

Po promíchání změřte absorbanci proti blanku při 400 nm.

Současně proveďte s aktivátorem - Mg^2+_ionty (roztok 2) a inhibitorem - fosfátem (roztok 3).Vypočtěte aktivitu alkalické fosfatasy v katalech, jestliže extinkční koeficient e = 18.8 mM^-1.cm^-1. Posuďte vliv inhibitoru a aktivátoru.

Jako vzorek použijte kontrolní sérum EXA E nebo Precinorm E.

2. Kinetické stanovení

Kinetická stanovení ALP proveďte setem fy Lachema Alkalická fosfatasa mikro, při použití vlnové délky 420 nm. Stanovení proveďte opět s kontrolním sérem a neznámým vzorkem (2x).

Stanovení cholesterolu

Cholesterol představuje jednu z nejdůležitějších složek lipidů krevného séra. Největší diagnostický význam má skutečnost, že zvýšená hladina cholesterolu je důležitým rizikovým faktorem pro vznik arteriosklerosy. V případě hypercholesterolemie se častěji setkáváme se srdeční nedostatečností a infarkty myokardu. Změny v koncentracích cholesterolu a dalších lipidů v krevním séru doprovázející různé patologické stavy organismu shrnuje následující tabulka:

	celkové lipidy	triacyl- glyceroly a mastné kys.	cholesterol	fosfolipidy
hypothyroidismus		N	++	+
diabetes mellitus	+	++	+	+
nefrotický syndrom	+	+	+	+
chronická pankreatitida	+	++	+	+
alkoholismus	+		+
obstrukční poškození jater	+	N	++	++
akutní virová hepatitida			+	+
Aterosklerosa	+	++	++	+

Do poředí zájmu vstoupilo vyšetřování cholesterolu v lipoproteinových frakcích, zejména HDL a LDL. Protože hladina cholesterolu je ovšem také výrazem hladiny lipoproteinů a obě uvedené frakce jsou cholesterolem bohaté, může cholesterol svědčit o poruše metabolismu lipoproteinů (HDL transportují cholesterol do jater a tím umožňují jeho odbourávání. Nízká hodnota cholesterolu v HDL je nepříznivým prognostickým znamením; ukazuje zvýšenou možnost srdečního infarktu).

K nízké hladině cholesterolu v HDL se zpravidla druží vysoká hodnota cholesterolu v LDL a naopak. U zdravých lidí ve věku 18 - 35 let je průměrně 29.3 % cholesterolu v HDL, u lidí po infarktu bylo nalezeno jen 14.1 % cholesterolu v HDL.

Úkoly:

Stanovte koncentraci triacylglycerolů v kontrolním séru REPROCHOL setem fy Sera-Pak; celkovou hladinu cholesterolu setem fy. Lachema a Chemelex a její frakci obsaženou v HDL setem HDL Cholesterol fy Chemelex.