Izoenzymy kreatinkinasy (CK) a laktátdehydrogenasy (LD)

Pro diferenciální diagnostiku poruch různých orgánů má velký význam posouzení aktivit některých orgánově selektivních enzymů a zejména izoenzymů. V této úloze jsou demonstrovány dva přístupy používané při analýze izoenzymového spektra v krevním séru - v případě kreatinkinasy je to využití specifické inhibice jednoho izoenzymu protilátkou, u LDH je využito odlišné substrátové specifity izoenzymů.

A) Kreatinkinasa je hojně zastoupena v různých tkáních (kosterní svalstvo, myokard, mozek, prostata, děloha). Enzym je dimerní; kombinací podjednotek M a B vytváří tři izoenzymy CK1 (BB), CK2 (MB) a CK3 (MM). Izoenzym MB kreatinkinasy je specifický pro srdeční tkáň, zatímco izoenzym MM se vyskytuje v kosterním svalstvu. Stanovení aktivity kreatinkinasy, a to zejména izoenzymu MB, má velký význam při diagnostice srdečních onemocnění. Distribuční rozložení izoenzymů v séru: 96-100 % MM, < 4 % MB.

Stanovení aktivity kreatinkinasyvyužívá indikační a pomocné enzymové reakce a Warburgův optický test:

 

CK

kreatinfosfát + ADP kreatin + ATP

 

hexokinasa

glukosa + ATP glukosa-6-P + ADP

 

G-6-PD

glukosa-6-P + NADP 6-fosfoglukonát + NADPH + H+

 

Monotest CK-MB fy. Merck obsahuje protilátky proti izoenzymu MM, a ty s ním vytvářejí komplex, který je enzymaticky inaktivní. Na izoenzym MB se protilátky nevážou, jeho enzymová aktivita je tedy neovlivněna.

B) Laktátdehydrogenasa

Tetramer LD vytváří 5 izoenzymů kombinací dvou typů podjednotek H (heart) a M (muscle): LD1 (H4), LD2 (H3M), LD3 (H2M2), LD4 (H3M) a LD5 (M4). K separaci a kvantifikaci jednotlivých izoenzymů se používají elektroforesa, ionexová chromatografie resp. imunoprecipitace; jinou možností je právě využití různé substrátové specifity těchto izoenzymů. Distribuce izoenzymů v krevním séru: LD1 18-33 %, LD2 28-40 %, LD3 18-30 %, LD4 6-16 % a LD5 2-13 %.

a) Stanovení celkové aktivity LD v séru

Proveďte stanovení celkové aktivity LD Warburgovým optickým testem fy. Sevac.

b) Stanovení a -hydroxybutyrátdehydrogenasy v séru

Toto stanovení využívá skutečnosti, že izoenzym LD1 je schopen poměrně účinně oxidovat i 2-oxobutyrát (a -hydroxybutyrát). Tento izoenzym se vyskytuje především v srdeční tkáni, jeho stanovení má hlavní význam při diagnostice infarktu myokardu. V játrech a plících je tohoto izoenzymu poměrně málo, nezanedbatelné aktivity však lze najít i v kosterním svalstvu, ledvinách a erytrocytech. Při vlastním stanovení postupujte podle návodu v setu fy. Sevac. Vyhodnoťte obsah izoenzymu LD1 na celkové aktivitě LD ve vašem vzorku.

 

Gestagnost - imunologický průkaz těhotenství

Gestagnost fy. Sevac slouží k průkazu choriongonádotropního hormonu v moči gravidních žen. Stanovení proveďte podle přiloženého návodu.