Elektroforéza v přítomnosti SDS – SDS PAGE

Elektroforéza v přítomnosti SDS – SDS PAGE je jednoduchá, rychlá a reprodukovatelná metoda pro kvalifikovanou charakterizaci a srovnání bílkovin.Tato metoda separuje  bílkoviny na základě rozdílné relativní molekulové hmotnosti.  SDS se zde váže  na bílkovinný řetězec v poměru 1.4 g SDS na 1g bílkoviny, přičemž délka komplexu SDS – bílkovina je úměrná jeho molekulové hmotnosti. Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je pak možné určit její relativní molekulovou hmotnost.

 

                                                elektromigrační dráha neznámé bílkoviny

Relativní mobilita (Rf )  =  ----------------------------------------------------                                         

                                                          celková délka elektroforézy

 

 

Kalibrační závislost Log MW = f (Rf )

 

 

 

I.  Příprava gelu

A. Sestavení gelového sendviče

Na stojánek položte držák, k jeho vnitřní straně umístěte delší sklo, na ně spacery a pak kratší sklo. Držák stáhněte a upněte ve stojánku.

B.  Nalévání separačního gelu.

 

Na  elektromagnetickou míchačku dejte kádinku s míchadlem a do ní pipetujte  roztoky  podle schématu, roztoky nepipetujte ústy !

 

 

1.3  ml  separačniho   pufru  pH  8.3

1.3    ml  roztoku  akrylamidu

2.5    ml  destilované  vody

50   μl    10 %  persíranu  amonného

  5   ul     TEMEDu

 

Promíchejte polymerizační směs zvýšením otáček a nasajte ji do injekční stříkačky. Směs opatrně nastříkněte mezi skla do výše zářezu a převrstvěte n-butanolem. Ponechte polymerovat tak dlouho, až se mezi gelem a vodnou fází vytvoří ostré rozhraní.

 

Slijte nezpolymerovanou část, promyjte vodou ze střičky a odsajte přebytek kapaliny filtračním papírem.

 

 

C.  Nalévání koncentračního gelu

 

Na  elektromagnetickou míchačku dejte kádinku s míchadlem  a do ní pipetujte roztoky podle schématu, roztoky nepipetujte ústy !

 

1.2     ml  koncentračního  pufru  pH

0.7     ml  roztoku  akrylamidu

3.1      ml  destilované  vody

50     ul   10 % persíranu  amonného

  5     ul   TEMEDu

 

Promíchejte polymerizační směs zvýšením  otáček a nasajte ji do injekční  stříkačky. Mezi skla  nastříkněte polymerizační  směs a  vložte  do ní  hřebínek. Ponechte polymerovat.

 

 

 

 

 

Vyjměte hřebínek z gelu a vzorkové jamky vypláchněte destilovanou vodou.  Gel vložte do vlhké komůrky.

 

 

 

 

II .  Elektroforéza

 

 

A. Sestavení  aparatury

 

Ke vnitřnímu elektrodovému  prostoru připevněte gel a prázdný držák s kratším sklem. Takto sestavený  vnitřní elektrodový prostor vložte do nádobky a naplňte elektrodovým pufrem.

 

 

 

Elektroforetická aparatura  Mini  Protean  II

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

B. Nanesení  vzorku.

 

Do vzorkových jamek  naneste pomocí stříkačky  20 ml  vzorku, tak abyste je podvrstvili pod  elektrodový pufr. Mezi  jednotlivými vzorky stříkačku vypláchněte destilovanou vodou.

 

 

C. Vlastní elektroforéza

 

Elektroforetickou aparaturu uzavřete víkem a připojte ji ke zdroji stejnosměrného napětí. Na zdroji nastavte konstantní napětí 125 V a po zapnutí ponechte elektroforézu probíhat tak dlouho, až zóna bromfenolové modři doputuje ke spodnímu okraji gelu.

 

 

 

D. Ukončení elektroforézy

 

                 Vypněte zdroj, otevřete elektroforetickou aparaturu, vyjměte z ní vnitřní elektrodový prostor, a slijte elektrodový pufr. Uvolněte z vnitřního elektrodového prostoru držák s gelem a opatrným zapáčením od sebe uvolněte skla. Z gelu odstraňte koncentrační část a zbytek přeneste do fixačního roztoku.

 

 

 III.  Detekce bílkovin stříbrem

 

krok                              roztoky                                                                      čas

 

1.         60  ml  50 %  acetonu, 1.5  ml  50 %  TCA ,  25 ml  37 % HCHO                 5 min

2.         opláchněte  3x deionizovanou vodou                                                               3 x 5 s

3.         promytí  deionizovanou  vodou                                                                    5 min

4.         opláchněte  3x  deionizovanou vodou                                                          3 x 5 s

5.         60  ml  50  %  acetonu                                                                                  5  min

6.         100  ml    10  %   Na2S2O3 v 60  ml  deionizované  vody                             1  min

7 .        opláchněte  3x  deionizovanou vodou                                                              3  x  5 s

8 .        0.8  ml  20  %  AgNO3 , 0.6  ml  37  %  HCHO ,   60  ml  H2O                     8  min

9 .        opláchněte  2x  deionizovanou vodou                                                              2  x  5 s

10.       60  ml  2  %  Na2CO3 , 25 ml   37  %  HCHO , 25  ml   10  % Na2 S2O3        10-20 s

11.       1  %  HAc                                                                                                     30 s

12.       promytí  deionizovanou  vodou                                                                       10 s

 

 

 

 

IV.  Sušení gelu

 

Gel  přeneste  do  1  %  roztoku  glycerínu  a  ponechte  jej  zde  15  minut  ekvilibrovat.  Do  stejného roztoku vložte na 5 minut celofánovou folii, gel a zalijte jej trochou glycerínového  roztoku. Gel překryjte celofánovou folií a  pomocí  skleněné  tyčinky vytlačte  gel  gumovou  membránou a vrchním víkem. Zapněte sušičku a ponechte gel sušit asi  2  hodiny  při  80  0 C.      

 

 

 

 

!!!!! Důležité upozornění !!!!!

 

 

Monomery používané pro přípravu gelu jsou neurotoxiny a proto :

 

·        roztoky nikdy nepipetujte ústy

·        pracujte v rukavicích

·        pracujte v digestoři