Relativně malá oblast enzymové molekuly, která obsahuje místo pro vazbu substrátu a katalytické místo pro přeměnu substrátu na produkt. Aktivní místo má tvar prohlubně nebo štěrbiny a neobsahuje vodu.
Místo pro vazbu substrátu je tvořeno aminokyselinovými zbytky, ke kterým se substrát váže nekovalentními interakcemi (vodíkové můstky, iontové interakce, hydrofobní interakce). Nepolární charakter aktivního místo zesiluje polární interakce mezi substrátem a enzymem.
Specifita enzymové katalýzy je výsledkem sterického uspořádání atomů, které je komplementární ke tvaru substrátu. Vazba substrátu do aktivního místa vyvolá konformační změny enzymu: teorie aktivního přizpůsobení.