Nativní forma DNA podle původního modelu Watsona a Cricka. Tuto sekundární strukturu zaujímá DNA při vysokém obsahu vody. Skládá se ze dvou polynukleotidových řetězců tvořících pravotočivou dvojšroubovici o průměru 2 nm. Roviny bází jsou takřka kolmé k ose šroubovice. Ideální B-DNA má 10 párů bází jednu otáčku interagujících vodíkovými vazbami s protějšími páry bází. Báze nacházející se nad a pod sebou spolu interagují tzv. stohováním báze(stacking).