Chromatografie založená na hydrofobních interakcích mezi dělenou látkou a hydrofobní pevnou fází. Hydrofobní fáze je tvořena alkylovými řetězci např. oktylovými nebo fenylovými skupinami kovalentně vázanými na obvyklou hydrofilní matrici používanou při dělení bílkovin (Sephadex, Sepharosa, apod.). Při dělení bílkovin se využívá skutečnosti, že hydrofobní vazby jsou silné v prostředí o vysoké iontové síle. Proto se nanášení vzorku provádí obvykle v 1-2 M síranu amonném. Eluce se provádí klesajícím gradientem iontové síly.