Produkce sacharidů z necukerných prekurzorů, jako je laktát, pyruvát nebo aminokyseliny. V užším slova smyslu se tak nazývá produkce glukosy z laktátu probíhající v játrech obratlovců (viz Coriho cyklus)
Glukoneogeneze probíhá zvratem anaerobní glykolýzy. Nevratným krokem je vznik fosfoenolpyruvátu z pyruvátu, jehož velmi nepříznivá DG se obchází karboxylací pyruvátu na oxalacetát , následuje přeměna na fosfoenolpyruvát. Další dva nevratné kroky jsou fosfofruktokinasová a hexokinasová reakce.

biotin, ATP ATP
CH₃COCOOH + CO₂ = HOOC.CH₂.CO.COOH = CH₂=C(OP)-COOH + ADP
 
Vznik PEP z oxalacetátu: